非洲猪瘟及其诊断技术

　　非洲猪瘟（Africa swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性和高度传染性的疾病[1,2]，几乎可以感染不同日龄的猪[3]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报的疫病，我国动物防疫法将其列为I 类动物疫病[4]。由于ASFV 结构复杂，存活时间长，基因组庞大且易变异，而且其大多数蛋白结构与功能尚不清楚，以至于目前尚无有效的疫苗来预防ASFV[5,6]。当下除了要加快有效疫苗的研发，更重要的是利用准确、快速的诊断技术及时做出准确的诊断，对于非洲猪瘟病毒的防控和净化具有重要意义。本文对非洲猪瘟及非洲猪瘟病毒诊断技术的研究进展进行综述，以期为非洲猪瘟病毒准确、快速诊断和疫病净化提供参考。

　　1 非洲猪瘟

　　1.1 病原学

　　非洲猪瘟病毒（ASFV）在病毒学分类上属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，是ASFV 家族的唯一成员[7]。ASFV 是二十面体对称结构的双链DNA 病毒，大小在175～215nm，全基因组总长为175～190kb[8,9]。根据目前的有关研究，ASFV 共有24 个基因型和1 个血清型，在我国流行的是基因Ⅱ型、血清8 群[10,11]。根据该病毒致病力的不同，可分为感染无临床症状毒株、低致病性毒株、中等毒力毒株、强毒力毒株[12]。其主要通过呼吸道和消化道侵染机体，使其免疫系统受损，进入血液后，引起组织器官出血[13]。

　　1.2 流行病学

　　猪是ASFV 唯一的自然宿主，不同品种、不同日龄的猪均可感染。钝缘蜱属昆虫是ASFV 的传播媒介和贮藏寄主[14,15]，该病毒也是唯一以钝缘蜱属昆虫为传播方式的DNA 病毒[4]。该病毒主要通过直接或间接接触带毒猪的体液、排泄物以及血液等进行传播[16]。目前尚未发现其能对人类以及其他动物具有感染性[17]。

　　1.3 临床症状

　　猪一旦被ASFV 感染后，典型临床症状表现为高热、食欲下降、皮肤发绀、呕吐、便血和共济失调等，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，甚至还伴随呼吸障碍等特征[2,18-20]。毒株毒力不同，引起的临床症状也不同，可分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型。强毒力毒株感染猪后，通常表现为最急性型或急性型。最急性型一般无明显症状，病猪突然死亡。急性型的病猪主要特点为高热、中度厌食、呼吸困难、便血、皮肤发绀等，处于妊娠期的母猪均会流产。并且强毒力毒株造成的病死率最高可达100%。中等毒力毒株主要引发非洲猪瘟亚急性型，其临床症状与急性型相似，但程度相对较低，病死率一般为30%～70%。低毒力毒株主要引发非洲猪瘟慢性型，临床症状表现为呼吸困难、湿咳、消瘦、关节肿胀等，病死率一般为10%～20%[21-23]。

　　2 非洲猪瘟诊断技术

　　2.1 病原学检测

　　2.1.1 病毒分离

　　采集病猪血液或器官组织对非洲猪瘟病毒进行分离，分离过程必须要在生物安全三级（包括三级）以上的实验室进行。在病毒分离过程中，将抗生素和培养液加到血液或研磨组织中，离心获取上清液，通过病变效应、红细胞吸附实验、间接免疫荧光试验等技术，确定猪是否感染非洲猪瘟[24,25]。

　　2.1.2 红细胞吸附试验

　　红细胞吸附试验（HAD）早在1960 年就已经建立[24]。试验时，将猪血液或组织制作的悬液接种在原代白细胞培养物中，镜检时，若出现有红细胞吸附在感染细胞表面，呈玫瑰花环或桑葚状现象，即可判定为阳性。该试验较烦琐且耗时长，对实验环境及实验操作人员的要求相对较高，具有一定的局限性[26,27]。

　　2.1.3 酶联免疫吸附试验

　　酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理是将抗体或抗原吸附在固相载体表面，检测样品中的抗原或抗体可与其特异性结合，形成抗原抗体复合物，将酶标抗体再与该复合物结合，根据加入底物的颜色反应即可判定结果[28]。随着该技术不断发展与应用，其检测结果也更加准确而有效，具有方便、快速、设备仪器要求低、成本低等优点。但是与红细胞吸附实验相比，其灵敏性和特异性较低，检测结果受样本影响较大；与PCR相比，其特异性和灵敏性低，易出现假阳性；样本易受保存环境温度影响，检测结果准确性不能得到保证[24]。

　　2.1.4 荧光抗体试验

　　荧光抗体试验（FAT）是对病猪冰冻切片或者组织切片进行抗原检测。检测时，将病猪的冰冻切片、组织切片或已在载玻片上涂有已接种白细胞培养物的细胞沉淀干燥后，浸入丙酮中进行固定，用异硫氰酸荧光素标记抗非洲猪瘟病毒抗体，再用PBS 液冲洗后，在荧光显微镜观察，如果胞浆中发现特异性荧光，判为阳性。该实验具有很强的敏感性和特异性，可快速、简便地得到非洲猪瘟病毒检测的结果。但实验对荧光素特异性要求较高，非特异性荧光素染色可能会造成假阳性的结果，对急性非洲猪瘟的灵敏度高。同时该实验对操作人员的要求较高，并且需要借助显微镜，难以实现现场检测，常作为检测非洲猪瘟病毒的辅助方法[11,25]。

　　2.1.5 聚合酶链式反应

　　聚合酶链式反应（PCR），具有敏感、快速、特异性高的特点，同时对样品的纯度、血液样品及组织的保存方式要求较低，被广泛应用于非洲猪瘟病毒的检测。Agüero 等[29]根据p72 保守基因序列，设计引物，建立了快速检测ASFV 的PCR 方法，且该方法得到OIE 认证。但2015 年有相关研究认为，该方法在检测中会出现假阴性结果[30]。为解决这个问题，Luo等根据p72 基因设计引物，检测不同地区4 个基因型的14 个代表毒株，表明该方法更为灵敏、准确，能相对全面的检测非洲猪瘟病毒[31]。

　　2.1.6 多重PCR

　　此技术是在PCR 技术的基础上建立并发展起来的，能在同一个反应体系中，同时加入多对引物，分别扩增到不同的靶标，获得相应目的片段[32]。还能对DNA 和RNA 病毒进行同时检测，效率较高，降低了试剂耗材成本。如五重RT-PCR 鉴别诊断方法，广泛应用于动物疫病的检测[33]。

　　2.1.7 纳米PCR

　　该技术是将纳米金属颗粒添加到普通PCR 反应中，使反应体系热导性更强，PCR 反应更快，可提高反应的特异性，消除非特异性扩增，提高扩增产物产量，纳米PCR 技术可使非洲猪瘟病毒检测的灵敏度增加至1000 倍[34]。

　　2.1.8 套式PCR

　　套式PCR 是先用外套引物进行一次扩增，再用内套引物对扩增产物进行第二次扩增，提高扩增的敏感性，该方法可从非洲软蜱中检测出非洲猪瘟病毒，可用于筛查不同种类蜱体内的非洲猪瘟病毒[35]。

　　2.1.9 实时荧光定量PCR

　　实时荧光定量PCR 技术，是在PCR 体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测PCR 反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[36]。该技术与常规PCR 相比较，检测过程简化，可对多个样品进行同时检测，检测的速度更快、灵敏度更高，并且特异性强、自动化程度高，有效解决常规PCR 污染等问题[37]。

　　2.1.10 等温扩增技术

　　等温扩增技术是核酸体外扩增技术，其始终维持在恒定温度进行反应。反应过程无需精密的仪器，具备恒温装备即可，并且操作简便，反应时间短。不足的是缺乏热循环中的变性、退火等程序，易出现假阳性，仅适用于疾病的初步筛查，在一定程度上限制了该技术的应用。且检测试剂盒中酶的成本较高，造成单个样品检测费用比普通荧光PCR 高[38]。

　　2.2 血清学检测

　　2.2.1 酶联免疫吸附试验

　　酶联免疫吸附试验（ELISA）是血清学检测方法中应用最广泛的检测技术，具有快速、灵敏、成本低、特异性高、准确性高等特点，适用于大规模样品的排查、疫病监测以及自动化血清学检测。一般情况下，国内外常用p30/p32、p54、p72、p73 等作为检测ASFV 抗体的蛋白，该方法可通过这些蛋白直接检测出较低或中等毒力感染猪抗体[37]。王彩霞等[39]以ASFV p72 蛋白为包被抗原，建立阻断ELISA 方法检测猪血清中抗ASFV p72 蛋白的抗体，对ASFV 阳性血清灵敏度最低为1∶128，具有较高的特异性、敏感性和良好的重复性。

　　2.2.2 胶体金试纸检测技术

　　胶体金试纸检测技术是将特异性抗原或抗体与胶体金结合，形成胶体金免疫复合物，胶体金聚集于检测线显色，通过观察显色反应，即可判定结果。该技术可通过目测法判断结果，不需要专业的仪器设备，具有操作简单，特异性、灵敏度高等特点，适合现场、基层、大规模排查或是生猪调运临场的使用[40]。张鑫宇等[2,41]于2014 年以非洲猪瘟p54 的重组蛋白为核心蛋白标记胶体金，再分别用葡萄球菌A 蛋白和抗p54 多抗作为检测线和质控线，按一定顺序制备非洲猪瘟p54 抗体胶体金试纸，建立了p54 抗体胶体金检测法，该试纸与猪的其他病毒抗体阳性血清无交叉反应，表明该检测法的敏感性和特异性高。

　　2.2.3 间接免疫荧光试验

　　间接免疫荧光试验是利用特异性抗体和样品中相应抗原反应，形成抗原抗体复合物，再用荧光标记的第二抗体与抗原抗体复合物结合，洗涤后在荧光显微镜下观察荧光。该试验敏感度高，但对试验条件及操作要求较高，常用于复核ELISA 检测中的可疑样品[24,37,40]。

　　3 小结

　　非洲猪瘟是我国重点防范的外来疫病之一，在全球已流行一百多年。自2018 年我国首次发生非洲猪瘟以来，我国生猪养殖业以及人们的日常生活都受到了严重的影响。目前尚无疫苗和药物可用于预防和治疗非洲猪瘟，因此，快速、有效、科学的诊断技术对非洲猪瘟防控尤为重要。该文从非洲猪瘟病原学、流行病学、临床症状及诊断技术等方面进行了综述，以期各个地区能根据实际情况，综合各种方法的优缺点，选择适当的方法进行检测。同时科研单位也应根据目前诊断技术的不足，加大力度研发更佳的诊断方法。

　　参考文献：(略)

　　来源：中国畜禽种业

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